[Tech] PCR상의 이미지 데이터 분석 알고리즘-아이씨엔매거진

PCR상의 이미지 데이터 분석 알고리즘
DNA 분석에서의 증폭 측정에 효율적인 알고리즘
본 글에서는 바이오칩 시스템에서 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)의 직접적인 정량화를 위한 이미지 분석 애플리케이션을 소개하고자 한다. 설계된 툴을 이용하면 디지털 이미지 프로세싱 알고리즘으로 디지털 입력 이미지에서 의미있는 정보를 추출할 수 있다. 이미지 분석은 마이크로칩 웰 형광(microchip wells fluorescence)을 읽는 것처럼 단순해질 수 있다. 이미지 데이터 추출을 최적화하기 위해 디지털 입력 이미지 로드, 웰 정렬 자동화 및 검출, 데이터 입력 정밀화, 셀의 통계적 평균 이미지 값 계산, 출력으로 적합커브(fitted curve) 작성, 각 웰에 사이클 임계값(Cycle Threshold, CT) 및 슬로프 파라미터 부여가 가능한 소프트웨어가 개발되었다. 실행된 수학적 모델을 통해 평균 형광 증폭 측정 및 PCR 커브 피팅을 쉽게 할 수 있다.

제공: ST마이크로 일렉트로닉스, www.st.com
Keywords: 이미지 분석, PCR, 에지 검출(Edge detection), 허프 변환(Hough transform)

서 론

지난 몇 년 동안, 미세유체(Microfluidic) 바이오칩이 진화함에 따라 생화학 연구분야에 변화가 있었다. 이와 같은 추세는 무엇보다 저렴하고 신속하며 신뢰성 높은 일반 바이오칩의 대량생산 덕분에 가능했다. 바이오칩은 미세유체를 이용한 생화학적 분석을 위한 모든 기본 기능, 즉 이동, 디스펜싱, 믹싱 등의 기능을 칩에 집적시킬 수 있다.

이런 장점 덕분에 바이오칩은 임상 진단, 특히 질병의 현장 진단 등에 혁명을 가져올 것으로 기대된다. 다른 적용 분야로는 종양학, 신약개발, DNA 분석, 면역분석법 등이 있다. 이미지 분석에서 DNA 형광 증폭(fluorescence amplification)을 측정하기 위해서는 바이오칩의 관심영역(Region Of Interest, ROI)에서 데이터 정보를 취득 및 추출하는 것이 기본이다. 이에 모든 사이클 스텝(온도 상승)마다 이미지를 얻을 수 있는 카메라를 갖춘 디바이스가 개발되었다. 이 방법을 통해 형광증폭이 있을 경우 측정할 수 있다. 모든 실험 시, 일회용 칩에 넣은 새 바이오칩을 버스 장치에 넣어야 한다. 바이오칩을 일회용 칩 및 카메라 장치와 결합하면 정렬 문제(alignment problems)가 발생한다. 이와 같은 문제는 알고리즘 자동 ROI 감지로 해결했는데 이를 통해 ROI에만 통계적 데이터 산출 가속화, 사용성 개선, 카메라와 바이오칩의 수동 정렬로 인한 인적 오류 배제, DNA 로딩 에러 및 웰의 이미지 카메라 수차 현상 제거도 가능했다[1].

바이오칩 개발 동기

전통적 생화학 연구방식을 랩온칩(Lab-on-a-Chip, LoC)이나 미세유체 바이오칩에 이전하는 것에 대해 최근 수년간 활발한 연구가 진행되어 왔다. 바이오칩은 다양한 생화학 분석 기능(디스펜서, 필터, 믹서, 분리기, 검출기 등)을 칩에 집적시켜 육안으로 볼 수 있는 생화학 프로세스를 서브밀리미터 단위로 축소할 수 있다[1, 2]. 마이크로시스템은 전통적 생화학 분석시스템 대비 여러 장점이 있다. 여러가지 분석이 같은 칩으로 통합 진행되어 샘플 및 시약량 축소, 생화학 반응속도 향가, 초감도 검출 및 시스템 처리율 향상 등이 가능하다.

미세유체 바이오칩은 임상 진단에 도움이 되는데 특히 현장에서 즉시 질병 진단을 하는데 유용하다. 또한 대규모 병렬 DNA 분석, 효소 및 단백체 분석, 암 및 줄기세포 연구, 자동화된 신약 개발 분야에도 적용할 수 있다[1, 2]. 따라서 바이오칩의 장점을 다음과 같이 요약할 수 있다.

* 바이오센싱(bio-sensing), 임상진단학, 신약개발의 혁명적 변화 가능성
* 사이즈 및 샘플량 감소
* 저비용
* 높은 초감도
문제점: ROI에서의 이미지 검출

모든 실험에서 중요한 것은 마이크로칩에서 ROI를 검출하는 것이다. 그렇기 때문에 칩 링, 일회용 칩 및 카메라의 정렬이 중요하다. 소프트웨어 최초 배포 버전의 경우 수동으로 그리드와 ROI를 정렬할 수 있지만 이와 같은 솔루션은 사용자 친화적이지 않다.

그림1. 50 사이클 후 형광을 보여주는 바이오칩 이미지. 빨간 화살표는 바이오칩에 LED 빛이 반사되는 것을 보여줌

이런 문제 해결을 위해 서로 다른 알고리즘을 탑재하고 자동으로 ROI를 검출하는 지능형 의사결정 시스템 생성하는 새로운 플로우 프로세스를 구현하여, 이를 통해 ROI에 대한 평균값 산출 및 모든 사이클의 PCR 산출이 가능하도록 했다.

실행 소프트웨어

개발된 소프트웨어는 두 개의 코어 모듈을 기반으로 한다.

1. Real Time PCR에서 나온 로우 데이터 분석을 위한 Fortran 소프트웨어 코드:

qPCR.exe: qPCR 코드는 형광 데이터를 입력으로, CT(사이클 임계값) 및 슬로프를 출력으로 한다. 이 코드는 Fortran 77 언어를 사용해 작성됐고 모든 운영시스템에서 컴파일이 가능하다. 여기서는 평가를 위해 윈도우 OS에서 컴파일했다. PCR 데이터 한 세트에 대한 qPCR 코드를 평가했다. RT-PCR 원시 데이터의 커브 피팅에 사용된 기능은 다음과 같은 다섯 파라미터의 시그모이드 커브(sigmoidal curve)이다[3]:

Real-Time PCR 데이터의 수치분석을 위한 Fortran 코드를 이용하면 위의 수학적 모델을 적용할 수 있다.

2. 디지털 이미지 분석 프로세스를 위한 자바 소프트웨어 코드:

(a) 모든 사이클의 디지털 이미지 취득
(b) 데이터 취득의 정확성 향상 및 보다 편리한 사용자 분석 플로우 프로세스를 위한 웰 정렬 자동화
(c) 이전 단계에 대한 모듈 qPCR.exe를 통한 통계적 데이터 산출 프로세스
(d) 시그모이드 분석을 위해 Real Time PCR의 통계적 데이터 값 표시

개발된 소프트웨어에 실행한 알고리즘 플로우 도표 및 방법:

1. 에지 검출 알고리즘 적용

a. 이미지 휘도(image luminance) 읽기
b. 이미지 콘트라스트 상승 및 정상화
c. 이미지 그라디언트 계산 (Gaussian Kernel 반지름 및 너비)
d. 상위 및 하위 이미지 임계값으로 이미지 히스테리시스(image hysteresis) 실행
e. 이미지 임계값 에지 산출
f. 산출된 에지를 새 이미지에 쓰기
g. 이미지 휘도 읽기
h. 이미지 콘트라스트 상승 및 정상화
i. 이미지 그라디언트 계산 (Gaussian Kernel 반지름 및 너비)
j. 상위 및 하위 이미지 임계값으로 이미지 히스테리시스 실행
k. 이미지 임계값 에지 산출
l. 산출된 에지를 새 이미지에 쓰기

이미지 휘도: 특정 방향으로 들어오는 단위 면적당 광밀도.

이미지 콘트라스트: 이미지에서 특정 오브젝트의 색(레드, 그린 또는 블루 메트릭스) 및 명도((R+G+B)/3) 의 차이로 결정.
이미지 그라디언트: 이미지의 강도 또는 색상의 방향적 변화. 이미지 그라디언트를 이용해 이미지로부터 정보를 추출할 수 있다. 이는 Gaussian Kernel 반지름 및 너비를 통해 산출한다.
이미지 히스테리시스: 이미지의 현재 색상 레벨뿐만 아니라 과거 색상 레벨에 대한 의존성. 고강도 그라디언트가 저감도 그라디언트 대비 에지와 부합할 가능성이 높은 원리에 기초한 것이다. 강도 그라디언트의 상위 및 하위 임계점을 정해 이미지 에지를 찾을 수 있다.

2. 허프 알고리즘(Hough Algorithm) 적용

a. 에지 이미지 로딩, 스텝에 생성, 이를 입력 이미지로 사용
b. 자동 검출 및 정렬을 위한 14×14 픽셀의 웰 참조 이미지를 이용해 허프 알고리즘 적용

허프 변환의 가장 단순한 예는 직선(y = mx + b) 검출을 위한 선형 변환이며 각 쌍의 이미지 포인트(x, y)에 대해 그래픽으로 표시할 수 있다.
방정식 y = mx + b는 파라미터 공간의 포인트(b, m)으로 나타낼 수 있다. 그러나 계산을 위해 허프 변환의 선에 대해 서로 다른 쌍의 파라미터(r, θ로 표시)를 이용하는 것이 낫다. 이것이 극좌표이다.
파라미터 r은 선과 0좌표간 거리, θ는 0좌표에서 최단점까지의 벡터 각도이다.
이와 같은 매개변수화를 이용하면 선의 방정식은 다음과 같다.

r = x cos θ + y sin θ

허프 변환 알고리즘은 y = mx + b 선을 검출하기 위해 어큐뮬레이터(accumulator)로 부르는 어레이(array)를 사용한다. 이 선의 경우, 선형 허프 변환 문제는 두 개의 미지의 파라미터 (r, θ)쌍을 갖고 있다.
각 픽셀 및 인접 픽셀의 경우, 허프 변환 알고리즘으로 해당 픽셀에 에지가 있는지 확인할 수 있다. 최대값, 일반적으로는 어큐뮬레이터 공간에서 로컬 최대값(local maxima)을 찾아 가장 가능성이 높은 선을 추출하고 대략의 기하학적 정의를 알 수 있다. 리턴 선은 길이 정보가 없기 때문에 이미지의 어떤 부분이 어떤 선과 일치하는지 확인할 필요가 있다.

실험 결과

그림 2에서 볼 수 있듯, 개발된 소프트웨어로 실험상의 문제를 해결할 수 있다.

* 바이오 칩 상의 LED 빛 이미지 반사 문제: 이와 같은 문제는 형광 증폭 측정에 영향을 미칠 수 있다. 그림1 및 2에서 볼 수 있듯이, 허프 변환은 웰의 잘못된 로드로 인한 문제 또는 바이오 칩의 빛 반사 문제를 피할 수 있다.
* 소프트웨어 사용 편의성: 클릭 한번으로 DNA 분석을 위한 PCR 결과 취득
* 각각의 실험에 사용된 카메라와 바이오 칩 간 수동 정렬로 인한 인적 평가 오류 배제

그림 5. 다음 그래픽에서 실험 데이터 및 데이터에 맞는 프로그램으로 추출한 관련 커브 확인

결 론

본 글에서는 스마트 자동 절차를 이용한 효율적 이미지 분석 알고리즘을 제시 및 설명했다. 여기서 제시한 알고리즘은 바이오칩에서 ROI 데이터 로드를 최적화하면서 산출 시간 비효율을 줄이기 위해 에지 검출 및 허프 변환 알고리즘을 사용한다.

실험 결과에 따르면 실행된 소프트웨어로 역학적 ROI 산출 및 모든 이미지 사이클에 대한 평균 형광값 로드가 가능하다. 이 때 소프트웨어 사용성이 높아지며 초기 실험 조건은 다양하다. 도표 5에서 각 사이클에 대한 PCR 시그모이드 커브는 소프트웨어 기능성을 보여준다.

이에 따라 평가 에러 및 그로 인한 잘못된 PCR 결과 및 비효율을 초래할 수 있는 사용자 개입을 크게 줄이려는 주 목표를 달성할 수 있다. 초기 결과에 따르면, 본 소프트웨어는 어느 정도의 좋은 성과를 보였지만 몇 가지 수정을 통해 사용성을 개선할 수 있다.

가까운 미래에 본 연구를 로봇 공학 또는 이미지 프로세싱 비전 시스템에 적용할 수도 있다[4]. 예를 들어 이런 아이디어를 로봇 시스템에 적용할 경우 형상 인식을 자동화해 인적 평가 오류를 배제할 수 있다.

References

Minhass, W.H.; Pop, P.; Madsen, J. Compilers: System-level modeling and synthesis of flow-based microfluidic biochips Architectures and Synthesis for Embedded Systems (CASES), 2011 Proceedings of the 14th International Conference on – Publication Year: 2011 , Page(s): 225 – 233
Maramis, C.; Delopoulos, A. : Efficient Quantitative Information Extraction from PCR-RFLP Gel Electrophoresis Images Pattern Recognition (ICPR), 2010 20th International Conference on Digital Object Identifier: 10.1109/ICPR.2010.627 Publication Year: 2010 , Page(s): 2560 – 2563.
Andrej-Nikolai Spiess, Caroline Feig and Christian Ritz (2008), Highly accurate sigmoidal fitting of real-time PCR data by introducing a parameter for asymmetry, BMC Bioinformatics, 9:221
Elouardi, A.; Bouaziz, S.; Dupret, A.; Klein, J.O.; Reynaud, R.: Image processing vision system implementing a smart sensor, Instrumentation and Measurement Technology Conference, 2004. IMTC 04. Proceedings of the 21st IEEE Volume: 1 Digital Object Identifier: 10.1109/IMTC.2004.1351085 Publication Year: 2004 , Page(s): 445 – 450 Vol.1

저자 소개.

Massimo Orazio Spata, massimo.spata@st.com (1)
Sabrina Conoci, sabrina.conoci@st.com (2)
Maria Eloisa Castagna, mariaeloisa.castagna@st.com (3)
Salvatore Rinaudo, salvatore.rinaudo@st.com (4)
1,2,3: STMicroelectronics, Department: IMS – Research & Development
4: STMicroelectronics